簡要描述：僅需將Phos-tag® Acrylamide與丙烯酰胺溶液混合并聚合，即可生成用于分離磷酸化和非磷酸化蛋白質的Phos-tag® SDS-PAGE。在不使用放射性同位素的情況下，利用 Phos-tag™ SDS-PAGE 即可分離不同條帶中的磷酸化和非磷酸化蛋白。分離后的凝膠可用于 Western blotting 和質譜分析等后續實驗。
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用于通過 SDS-PAGE 分離磷酸化蛋白質
Phos-tag® Acrylamide
僅需將Phos-tag® Acrylamide與丙烯酰胺溶液混合并聚合，即可生成用于分離磷酸化和非磷酸化蛋白質的Phos-tag® SDS-PAGE。
在不使用放射性同位素的情況下，利用 Phos-tag™ SDS-PAGE 即可分離不同條帶中的磷酸化和非磷酸化蛋白。分離后的凝膠可用于 Western blotting 和質譜分析等后續實驗。
Phos-tag™ SDS-PAGE 操作簡單，只需在常規 SDS-PAGE 膠中加入 Phos-tag™ Acrylamide 和 Mn2+ 或者 Zn2+ 即可進行實驗。在電泳過程中，磷酸化蛋白的磷酸基團與 Phos-tag™ 中的二價金屬離子相結合，降低其遷移速度，從而可區分磷酸化與非磷酸化蛋白。
◆優點、特色
● 采用 Phos-tag™ SDS-PAGE 可輕松分離磷酸化蛋白
無任何放射性元素及化學標記！
● 不論氨基酸殘基的類型/位點如何，均可使用
可用于未知的磷酸化分析
可用于檢測新的磷酸化位點（無需購買商品化磷酸化抗體、無需特意制備磷酸化抗體）
● 磷酸化位點數量/位點不同的磷酸形式也可分離
顯示磷酸化程度和磷酸化形式
● 可同時檢測磷酸化/非磷酸化形式
可定量各種磷酸化形式
可簡單明確有無磷酸化
● 無需RI或特殊的儀器
實驗成本低，操作簡單。（SDS-PAGE的試劑→只要有設備即可使用）
● 電泳后可用于WB、MS分析，也可用于二維電泳
WB：可分析內源性蛋白
MS：可顯示各磷酸化形式的磷酸化位點的組合
二維電泳：可分離相同等電點和分子量的磷酸化形式
適用于內源性蛋白的磷酸化分析！
◆Phos-tag® SDS-PAGE的原理
Phos-tag® Acrylamide的結構
1. 電泳中的磷酸化蛋白會被2個二價金屬離子捕獲
2. 磷酸化水平越高，電泳速度越慢
3. 根據磷酸化水平進行分離（即使磷酸化位點的數量相同，只要位置不同也可進行分離）
常規的SDS-PAGE（上圖：非Phos-tag® 條件下）中，無法確認底物是否被磷酸化。
◆案例、應用
【使用Phos-tag™ SDS-PAGE的磷酸化/非磷酸化蛋白比較】
“我推薦使用Phos-tag ™ ——東京大學研究院醫學研究科 小川覺之"
Phos-tag ™ 是專為研究磷酸化蛋白而新開發出來的試劑。此產品使用方便，不但可用于體外實驗，還能定量分析體內蛋白的磷酸化水平。Phos-tag ™ SDS-PAGE 可用于常規電泳實驗，無需購買特殊設備，性價比高。傳統蛋白磷酸化的研究需要特異的磷酸化抗體、RI 等其它試劑，操作復雜，花費大，且放射性元素會有安全隱患，而 Phos-tag ™ 的出現恰恰可以彌補這些缺點，為磷酸化蛋白研究提供新的方向。
磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白利用Phos-tag ™ SDS-PAGE 的分離效果圖
Lane 1 為非磷酸化蛋白，Lane 2-5 為磷酸化蛋白，各蛋白因磷酸化狀態不同而條帶遷移率也有所不同。
磷酸化/ 非磷酸化蛋白的數量比、磷酸化程度、磷酸化蛋白的豐度等都可根據條帶遷移和條帶濃度求得。
【資料提供】
日本東京大學研究生院醫學系研究科
【二維電泳中的應用：分析 hnRNP K 磷酸化異構體】
小鼠巨噬細胞 J774.1 經 LPS 刺激后，裂解細胞，經過免疫沉淀法分離得到 hnRNP K 。在二維電泳中，一維是IPG 膠，二維是 Phos-tag ™ SDS-PAGE，可分離 hnRNP K 的異構體。利用質譜儀，可以確認不同的點代表不同的亞型或修飾蛋白。
二維電泳
同一個等電點的位置上，不同位點發生磷酸化都可以被區分開來（例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7）
【參考文獻】
Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics , Nov 2010; 10(21): 3884-95.
【結果提供】
橫濱市立大學 生命納米系統科學研究科 生物體超分子系統科學專業 木村彌生（Dr. Y. Kimura）、平野久（Dr. H. Hirano）理化學研究所 RCAI 小原收
【EGF 刺激前后MAPK 磷酸化水平的變化】
常規 SDS-PAGE 和Phos-tagTM SDS-PAGE 后迚行克疫印跡實驗分析 EGF 刺激的 A431 細胞中 MAPK 磷酸化水平。
摘自 Kinoshita-Kikuta, E. et al., Mol.Cell. Proteomics. (2007)6: 356.
【使用示例：α-酪蛋白去磷酸化反應隨時間的變化】
使用Phos-tag® SDS-PAGE和常規SDS-PAGE分離堿性磷酸酶隨時間（孵育時間：0~120 min）去磷酸化的α-酪蛋白樣品。
◆相關產品
產品名稱 | 用 途 |
Phos-tag™ Acrylamide | 分離: SDS - PAGE 分離不同磷酸化水平的蛋白 |
SuperSep Phos-tag™ | 分離: 預制膠中含有50μM Phos-tag™ Acrylamide |
Phos-tag™ Biotin | 檢測: 代替 Western Blot 檢測中的磷酸化抗體 |
Phos-tag™ Agarose | 純化: 通用柱層析，純化磷酸化蛋白 |
Phos-tag™ Mass Analytical Kit | 分析: 用于質譜 MALDI-TOF/MS 分析，提高磷酸化分子的檢測靈敏度 |
phos-tag™ 由日本廣島大學研究生院醫齒藥學綜合研究科醫藥分子功能科學研究室開發，對應指導手冊請見相關資料。
| 產品編號 | 產品名稱 | 產品規格 | 產品等級 | 備注 |
| 304-93526 | Phos-tag Acrylamide AAL-107 5mM Aqueous Solution Phos-tag 丙烯酰胺5mM水溶液 | 0.3 mL | 蛋白研究 | 溶液型 |
| 300-93523 | Phos-tag Acrylamide AAL-107 Phos-tag 丙烯酰胺 | 2 mg | 蛋白研究 | 粉末型 |
| 304-93521 | Phos-tag Acrylamide AAL-107 Phos-tag 丙烯酰胺 | 10 mg | 蛋白研究 | 粉末型 |
| 產品編號 | 產品名稱 | 產品規格 | 產品等級 | 備注 |
| 301-93531 | Phos-tag™ Biotin BTL-104 Phos-tag™ 生物su | 10 mg | - | - |
| 308-97201 | Phos-tag Biotin BTL-111 1mM Aqueous Solution Phos-tag™ 生物su素1mM水溶液 | 0.1 mL | - | - |
| 387-07321 | Phos-tag™ Tip Phos-tag™ 瓊脂糖槍頭 | 8 pcs | - | - |
| 192-17401 | SuperSep™ Phos-tag™ (50 μmol/L), 6%, 13 well Phos-tag™ 預制膠50 μmol/L，6%，13孔 | 5 塊 | 電泳用 | - |
| 199-17391 | SuperSep™ Phos-tag™ (50 μmol/L), 6%, 17 well Phos-tag™ 預制膠50 μmol/L，6%，17孔 | 5 塊 | 電泳用 | - |
| 193-16691 | SuperSepTM Phos-tag™ (50 μmol/L), 15%, 13 well Phos-tag™ 預制膠50 μmol/L，15%，13孔 | 5 塊 | 電泳用 | - |
| 193-16711 | SuperSep™ Phos-tag™ (50 μmol/L), 10%, 13 well Phos-tag™ 預制膠50 μmol/L，10%，13孔 | 5 塊 | 電泳用 | - |
| 196-16701 | SuperSep™ Phos-tag™ (50 μmol/L), 15%, 17 well Phos-tag™ 預制膠50 μmol/L，15%，17孔 | 5 塊 | 電泳用 | - |
| 190-16721 | SuperSep™ Phos-tag™ (50 μmol/L), 10%, 17 well Phos-tag™ 預制膠50 μmol/L，10%，17孔 | 5 塊 | 電泳用 | - |
| 195-17371 | SuperSep™ Phos-tag™ (50 μmol/L), 7.5%, 13 well Phos-tag™ 預制膠50 μmol/L，7.5%，13孔 | 5 塊 | 電泳用 | - |
| 192-17381 | SuperSep™ Phos-tag™ (50 μmol/L), 7.5%, 17 well Phos-tag™ 預制膠50 μmol/L，7.5%，17孔 | 5 塊 | 電泳用 | - |
| 193-16571 | SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/L), 12.5%, 17 well Phos-tag™ 預制膠50 μmol/ L，12.5%，17孔（用于Wako EasySeparator電泳儀） | 5 塊 | 電泳用 | - |
| 195-16391 | SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/L), 12.5%, 13 well Phos-tag™ 預制膠50μmol/L ，12.5%，13孔 | 5 塊 | 電泳用 | - |
| 305-93551 | Phos-tag™ Mass Analytical Kit Phos-tag™ 質譜分析試劑盒 | 1 Set | 電泳用 | - |
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